Cell Surface Biotinylation Protocol

Biotinylation käyttää kyky liukoisen vitamiinin biotiinia sitoutuvan solun proteiineihin. Biotiini sitoutuu proteiini streptavidiini, ja on näin ollen käyttökelpoinen solubiologian visualisoida solun proteiineja. Biotinylointi mahdollistaa turvallisen merkintöjä proteiinien verrattuna tekniikoita, kuten radioaktiivisuuden ja ei vaikuta solun normaalin toiminnan. Sen avulla tutkijat voivat tutkia solun proteiineja, kuten reseptoreihin, ja joka mahdollistaa enemmän tietoa sairauksista ja taudin prosesseja. Merkinnät Keskeytetty Solut

Pese solut jääkylmään fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) epäpuhtauksien poistamiseksi. Puskureita, joka sisältää tris-ja glysiiniä kilpailevat biotinylaatio ja sitä tulisi välttää. Välttämiseksi biotinyloi sisäisiä proteiineja, merkinnät voidaan suorittaa 4 astetta tai läsnäollessa atsidi. Resuspendoi solut PBS ja liukoisen biotiinia, sulfo-NHS-LC-biotiini.
Nimeäminen kiinnittyneet solut

Wash solut PBS ja inkuboidaan kanssa tuotetta, kuten sulfo -NHS-LC-biotiinia. Sitten solut kaavitaan astiaan ja hajotettiin puskurissa, joka sisälsi pesuainetta Triton-X-100 ja valmistellaan visualisointi.
Preparing Merkityt solut

jälkeen Inkubaation jälkeen solut lingotaan osaksi pelletti ja pestiin PBS: ssä. Solut suspendoidaan uudelleen PBS: ään ja puhdistettiin IgG-Sepharose-geeliä. Sitoutunut proteiini laimennetaan latauspuskuriin ja kuumennettiin 100 ° C asteeseen.
Visualisointiin Cells

Laimennettu proteiinit voidaan visualisoida käyttämällä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS- PAGE), jota seurasi blottauksella proteiinin kanssa ja entsyymi sekoitetaan, streptavidiini-piparjuuren peroksidia. Pyyhkii ovat visualisoitiin kemiallinen reaktio --- kemiluminesenssin --- joka säteilee valoa. Erityisyys biotinylaation voidaan vahvistaa vasta-proteiinin tutkimuksessa.