Miten Test for Nucleic Acids

testaus nukleiinihappojen suoritetaan lääketieteellisessä diagnostiikassa, jotta voidaan havaita taudinaiheuttajia, kuten viruksia tai bakteereja. Nämä testit ovat paljon nopeampia ja siten mahdollistaa lääkäri aloittaa hoidon potilas normaalisti olisi joutunut odottamaan vahvistusta infektion käyttämällä enemmän pitkiä ja tylsiä vasta perustuvissa määrityksissä. Prosessi tunnetaan myös nukleiinihappo-testi, ja se sisältää menetelmä tunnetaan nimellä "käänteiskopioijaentsyymin vahvistusta" polymeraasiketjureaktiolla. Koska tämä on pitkälle erikoistunut tieteellinen menettely, kehittynyttä osaamista ja asiantuntemusta molekyylibiologian tekniikoita ja teoriaa tarvitaan. Asiat Tarvitset
PCR-putkiin
PCR cycler
pipetit ja suodatinkärjet
Käsineet
Cells
Trizol tai muita RNA uuttoreagenssi
PCR-puskuri
Taq polymeraasi
RT-PCR-alukkeita, 1 mg /ml pitoisuus
RNaasi-vapaaseen veteen
dNTP
MgCl2:
Random alukkeita 1,8 mg /ml: n pitoisuus
SuperScript II käänteiskopioijaentsyymin

Näytä Enemmän Ohjeet
käsittely ja valmistelu RNA
1

Harvest solujen RNA uuttoreagenssi, kuten Trizol. 1 ml: n, on riittävä kerätä soluja yhteen kuoppaan ja kuuden hyvin kudosviljelmälevylle. Solut perusteellisesti pipetoidaan ylös ja alas homogenoidaan ne ja sitten suorittaa uutto kuvatun Trizol lomakkeessa. Lyhyesti, uutetaan kloroformilla, sitten sentrifugoidaan faasien erottamiseksi DNA-, proteiini-ja RNA: ta. Takaisin vain väritön RNA vaihe ja sakka isopropanolilla. Inkubaation jälkeen lingot, että sekä puhdistaa tuloksena pelletti useita etanolipesujen. Sitten suspendoidaan pelletti uudelleen RNaasittomasta vettä.
2

käänteiskopioinnin, denaturoimaan tarkalleen 5 mikrogrammaa RNA 65 astetta 10 mikrolitran (UL) määrä RNaasittomasta vettä, sitten nopeasti paikka jäällä. Kunkin reaktio, yhdistää 10 ui RNA: ta, 3 ui 10X PCR-reaktio-puskuria, 2,5 ui 10-millimolaarista dNTP: tä, 6 l 25 millimoolia magnesiumkloridia, 1 ul satunnaisia ​​alukkeita ja 1,8 milligramman pitoisuus, ja 0,5 ul SuperScript II käänteiskopioijaentsyymin entsyymi. Täytä jokainen reaktio 17 ul RNaasittomasta vettä. Inkuboi putkia huoneen lämpötilassa kymmenen minuuttia ja sitten 42 ° C: ssa tunnin ajan tuottaa cDNA, sitten laimentavat klo 95 Celsius-astetta ja nopeasti jään reaktion pysäyttämiseksi.
3

ja polymeraasiketjureaktio, jälleen perustaa reaktioseoksesta 0,5 ml: n putkissa yhdistämällä 6 ui cDNA tehdään käänteistranskriptioreaktio, 1,5 ui 10X PCR-reaktio-puskuria, 0,2 mikrolitraa Taq-polymeraasia, 0,5 mikrolitraa käänteisaluketta ja myös eteenpäin pohjamaali, sitten lisätkää jokainen putki 10,3 ul RNaasittomasta vettä. Voit suorittaa reaktioita, perustaa lämpösyklilaitetta (eli kone, joka suorittaa polymeraasiketjureaktioilla) 30 sykliä seuraavasti: 95 asteessa 0,5 minuutin denaturointivelvollisuutta, jonka jälkeen 60 asteessa 45 sekunnin ajan hehkuttaa, ja lopulta 72 astetta Celsius 1 minuuttia laajentaa synteettisesti transkriptio.